Stolový gigapixelový mikroskop: 10 krokov (s obrázkami)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Naposledy zmenené: 2024-01-30 11:59

V optických mikroskopoch existuje zásadný kompromis medzi zorným poľom a rozlíšením: čím jemnejšie detaily, tým menšia je oblasť zobrazená mikroskopom. Jedným zo spôsobov, ako prekonať toto obmedzenie, je preložiť vzorku a získať obrázky vo väčšom zornom poli. Základnou myšlienkou je spojiť veľa obrázkov s vysokým rozlíšením a vytvoriť veľký zorný uhol. Na týchto obrázkoch vidíte úplnú ukážku a jemné detaily v akejkoľvek časti vzorky. Výsledkom je obrázok pozostávajúci z približne miliardy pixelov, oveľa väčší v porovnaní so snímkami nasnímanými dSLR alebo inteligentným telefónom, ktoré majú zvyčajne približne 10 až 50 miliónov pixelov. Pozrite sa na tieto gigapixelové krajiny a urobte pôsobivú ukážku obrovského množstva informácií na týchto obrázkoch.

V tomto návode sa pozriem na to, ako zostrojiť mikroskop schopný zobrazenia zorného poľa 90 mm x 60 mm s pixelmi zodpovedajúcimi 2 μm na vzorke (aj keď si myslím, že rozlíšenie je pravdepodobne bližšie k 15 μm). Systém používa objektívy fotoaparátov, ale rovnaký koncept je možné použiť aj pomocou mikroskopických objektívov, aby ste získali ešte jemnejšie rozlíšenie.

Odovzdal som gigapixelové obrázky, ktoré som získal pomocou mikroskopu, na server EasyZoom:

1970 obrázok časopisu National Geographic

Háčkovaný obrus, ktorý vyrobila moja manželka

Rôzna elektronika

Ďalšie zdroje:

Návody na optickú mikroskopiu:

Optické rozlíšenie:

Okrem zošívania obrázkov umožňuje nedávny pokrok vo výpočtovom zobrazovaní aj gigapixelovú mikroskopiu bez toho, aby sa vzorka dokonca pohla!

Krok 1: Zoznam dodávok

Materiály:

1. Nikon dSLR (použil som svoj fotoaparát Nikon D5000)

2. Objektív s ohniskovou vzdialenosťou 28 mm so závitom 52 mm

3. Objektív s ohniskovou vzdialenosťou 80 mm a 58 mm závitom

4. Spätná spojka 52 mm až 58 mm

5. Statív

6. Sedem listov 3 mm hrubej preglejky

7. Arduino Nano

8. Dva mostíky H L9110

9. Dva IR žiariče

10. Dva IR prijímače

11. Stlačte tlačidlo

12. Dva odpory 2,2 kOhm

13. Dva 150Ohm odpory

14. Jeden odpor 1 kOhm

15. Diaľkové ovládanie pre fotoaparát Nikon

16. Čierna plagátová tabuľa

17. Hardvérová súprava:

18. Dva krokové motory (použil som bipolárny krokový motor Nema 17 3,5 V 1A)

19. Dve 2 mm vodiace skrutky

20. Štyri vankúšové bloky

21. Dve skrutky vodiacej skrutky

22. Dve ložiskové klzné puzdrá a 200 mm lineárne hriadele:

23. Napájanie 5V:

24. Drôt obalený drôtom

Náradie:

1. Laserová rezačka

2. 3D tlačiareň

3. Imbusové kľúče

4. Nožnice na drôty

5. Nástroj na ovinutie drôtu

Krok 2: Prehľad systému

Na preklad vzorky prechádzajú dva krokové motory zarovnané v ortogonálnych smeroch o stupeň v smere xay. Motory sú ovládané pomocou dvoch H-mostíkov a Arduina. Infračervený senzor umiestnený v spodnej časti krokového motora sa používa na vynulovanie stupňov, aby nenarazili na žiadny koniec blokov. Digitálny mikroskop je umiestnený nad stupňom XY.

Akonáhle je vzorka umiestnená a stolík je vycentrovaný, akvizíciu spustíte stlačením tlačidla. Motory presunú pódium do dolného ľavého rohu a spustí sa kamera. Motory potom v malých krokoch prekladajú vzorku, pretože fotoaparát fotografuje v každej polohe.

Keď sú nasnímané všetky obrázky, obrázky sú potom spojené dohromady a vytvoria gigapixelový obrázok.

Krok 3: Zostavenie mikroskopu

Vyrobil som mikroskop s malým zväčšením s dSLR (Nikon 5000), objektívom Nikon 28 mm f/2,8 a zoomom Nikon 28-80 mm. Objektív so zoomom bol nastavený na ohniskovú vzdialenosť rovnú 80 mm. Sada dvoch šošoviek funguje ako šošovka mikroskopu a šošovka. Celkové zväčšenie je pomer ohniskových vzdialeností, približne 3X. Tieto šošovky nie sú skutočne navrhnuté pre túto konfiguráciu, takže aby sa svetlo šírilo ako mikroskop, musíte medzi obidve šošovky umiestniť doraz clony.

Najprv nasaďte na fotoaparát objektív s dlhšou ohniskovou vzdialenosťou. Vystrihnite kruh z čiernej plagátovej dosky, ktorá má priemer zhruba ako predná plocha šošovky. Potom v strede nakrájajte malý kruh (ja som vybral priemer asi 3 mm). Veľkosť kruhu určí množstvo svetla, ktoré vstupuje do systému, nazývaného aj numerická clona (NA). NA určuje bočné rozlíšenie systému pre dobre navrhnuté mikroskopy. Prečo teda pre toto nastavenie nepoužiť vysokú NA? Existujú dva hlavné dôvody. Po prvé, keď sa NA zvyšuje, optické aberácie systému sa stávajú výraznejšími a obmedzia rozlíšenie systému. V netradičnom nastavení, ako je toto, to pravdepodobne bude tento prípad, takže zvýšenie NA nakoniec už nepomôže zlepšiť rozlíšenie. Za druhé, hĺbka ostrosti závisí aj od NA. Čím vyššia je NA, tým menšia je hĺbka ostrosti. To sťažuje zaostrenie na objekty, ktoré nie sú všetky ploché. Ak sa NA príliš zvýši, budete sa obmedzovať na zobrazovacie mikroskopické sklíčka, ktoré majú tenké vzorky.

Vďaka umiestneniu zarážky clony medzi obidve šošovky je systém zhruba telecentrický. To znamená, že zväčšenie systému je nezávislé od vzdialenosti objektu. To je dôležité pre spájanie obrázkov dohromady. Ak má objekt rôznu hĺbku, pohľad z dvoch rôznych polôh bude mať posunutú perspektívu (ako ľudské videnie). Spájanie obrázkov dohromady, ktoré nie sú z telecentrického zobrazovacieho systému, je náročné, najmä pri takom vysokom zväčšení.

Pomocou reverznej spojky objektívu 58 mm až 52 mm pripevnite 28 mm objektív na 80 mm objektív s otvorom umiestneným v strede.

Krok 4: Návrh pódia XY

Štádium som navrhol pomocou Fusion 360. Pre každý smer skenovania existujú tri časti, ktoré je potrebné vytlačiť 3D: montážny držiak, dva predlžovače posuvných jednotiek a držiak vodiacej skrutky. Základňa a plošiny stupňa XY sú rezané laserom z preglejky hrubej 3 mm. Základňa drží motor a posúvače v smere X, platforma X drží motor a posúvače v smere Y a plošina Y obsahuje vzorku. Základňa sa skladá z 3 listov a dve platformy sa skladajú z 2 listov. V tomto kroku sú poskytnuté súbory na rezanie laserom a 3D tlač. Po vystrihnutí a vytlačení týchto dielov ste pripravení na ďalšie kroky.

Krok 5: Zostava držiaka motora

Pomocou nástroja na navíjanie drôtu omotajte vodič okolo vodičov dvoch IR žiaričov a dvoch IR prijímačov. Farebne označte vodiče, aby ste vedeli, ktorý koniec je ktorý. Potom odrežte vodiče z diód, takže od tej doby vedú iba drôty na ovinutie. Prevlečte vodiče cez vodidlá v držiaku motora a potom zatlačte diódy na miesto. Vodiče sú vedené tak, aby neboli viditeľné, kým nevystúpia zo zadnej časti jednotky. Tieto vodiče je možné spojiť s vodičmi motora. Teraz namontujte krokový motor pomocou štyroch skrutiek M3. Tento krok zopakujte pre druhý motor.

Krok 6: Zostavenie pódia

Prilepte k sebe rezy základne 1 a základne 2, jeden z nich so šesťhrannými otvormi pre matice M3. Keď lepidlo zaschne, zatlačte matice M3 na svoje miesto. Matice sa pri zatlačení do dosky neotáčajú, takže skrutky budete môcť neskôr zaskrutkovať. Teraz prilepte tretí základný list (základ 3), aby zakryl matice.

Teraz je čas zostaviť držiak olovenej matice. Uvoľnite z držiaka všetky prebytočné vlákna a potom zatlačte štyri matice M3 na svoje miesto. Sú tesne priliehajúce, takže pomocou malého skrutkovača uvoľnite priestor pre skrutky a matice. Akonáhle sú matice zarovnané, zatlačte vodiacu maticu do držiaka a pripevnite ju 4 skrutkami M3.

Na základňu pripevnite bloky vankúšov, úchytky posuvníka a držiak motora pre lineárny prekladač v smere X. Nasaďte zostavu vodiacej matice na vodiacu skrutku a potom zasuňte vodiacu skrutku na miesto. Pomocou spojky pripojte motor k vodiacej skrutke. Umiestnite posuvné jednotky do tyčí a potom zasuňte tyče do úchytiek posúvača. Nakoniec pripevnite predlžovače upevnenia posuvníka pomocou skrutiek M3.

Listy preglejky X1 a X2 sú k sebe prilepené podobným spôsobom ako základňa. Rovnaký postup sa opakuje pre lineárny translátor v smere Y a pre fázu vzorky.

Krok 7: Elektronika skenera

Každý krokový motor má štyri káble, ktoré sú pripojené k modulu mostíka H. Štyri káble z IR vysielača a prijímača sú pripojené k odporom podľa vyššie uvedenej schémy. Výstupy prijímačov sú prepojené s analógovým vstupom A0 a A1. Dva moduly H-bridge sú pripojené k pinu 4-11 na Arduino Nano. Na kolík 2 je pripojené tlačidlo s odporom 1 kOhm pre jednoduché zadanie používateľom.

Nakoniec je spúšťacie tlačidlo dSLR pripojené k diaľkovej uzávierke, ako som to urobil pre svoj CT skener (pozri krok 7). Odrežte kábel diaľkovej uzávierky. Vodiče sú označené nasledovne:

Žltá - zaostrenie

Červená - uzávierka

Biela - zem

Aby bolo možné zamerať výstrel, musí byť žltý vodič spojený so zemou. Ak chcete nasnímať fotografiu, žltý aj červený vodič musia byť uzemnené. Pripojil som diódu a červený kábel na kolík 12 a potom som pripojil ďalšiu diódu a žltý kábel na kolík 13. Nastavenie je popísané v pokynoch pre domácich majstrov a How-Tos.

Krok 8: Získanie gigapixelových obrázkov

V prílohe je kód pre gigapixelový mikroskop. Na ovládanie motorov pomocou H-mostíka som použil knižnicu Stepper. Na začiatku kódu musíte zadať zorné pole mikroskopu a počet obrázkov, ktoré chcete získať v každom smere.

Napríklad mikroskop, ktorý som vyrobil, mal zorné pole asi 8,2 mm x 5,5 mm. Preto som nasmeroval motory na posun 8 mm v smere x a 5 mm v smere y. Získa sa 11 snímok v každom smere, čo predstavuje 121 snímok pre úplný gigapixelový obrázok (ďalšie informácie o tom v kroku 11). Kód potom vypočíta počet krokov, ktoré musia motory urobiť, aby preložili stupeň o túto sumu.

Ako tieto stupne vedia, kde sú vzhľadom na motor? Ako sa fázy prekladajú bez toho, aby sa trafili do oboch strán? Do kódu nastavenia som napísal funkciu, ktorá posúva pódium v každom smere, kým nepreruší cestu medzi IR vysielačom a IR prijímačom. Keď signál na infračervenom prijímači klesne pod určitú prahovú hodnotu, motor sa zastaví. Kód potom sleduje polohu pódia vzhľadom na túto domácu polohu. Kód je napísaný tak, aby sa motor nepreložil príliš ďaleko, čo by viedlo k tomu, že by stupeň bežal na druhý koniec vodiacej skrutky.

Akonáhle je stolík kalibrovaný v každom smere, stupeň sa prenesie do stredu. Pomocou statívu som umiestnil mikroskop dSLR nad pódium. Na scéne vzorky je dôležité zarovnať pole kamery so skríženými čiarami. Akonáhle je pódium zarovnané s kamerou, prelepil som pódium maliarskou páskou a potom som umiestnil vzorku na pódium. Zaostrenie bolo upravené v smere z statívu. Užívateľ potom stlačením tlačidla začne akvizíciu. Fáza sa presunie do ľavého dolného rohu a spustí sa kamera. Fáza potom raster naskenuje vzorku, pričom fotoaparát v každej polohe nasníma fotografiu.

Priložený je aj kód na riešenie problémov s motormi a infračervenými snímačmi.

Krok 9: Spájanie obrázkov

So všetkými získanými obrázkami stojíte teraz pred výzvou spojiť ich všetky dohromady. Jedným zo spôsobov, ako zvládnuť zošívanie obrázkov, je ručné zarovnanie všetkých obrázkov v grafickom programe (použil som program Autodesk's Graphic). To bude určite fungovať, ale môže to byť bolestivý proces a okraje obrázkov sú na gigapixelových obrázkoch viditeľné.

Ďalšou možnosťou je použiť techniky spracovania obrázkov na automatické spojenie obrázkov. Cieľom je nájsť podobné funkcie v prekrývajúcej sa časti susedných obrázkov a potom na obrázok použiť prekladovú transformáciu, aby boli obrázky navzájom zarovnané. Nakoniec môžu byť okraje zmiešané spolu vynásobením prekrývajúceho sa úseku lineárnym hmotnostným faktorom a ich súčtom. Ak začínate so spracovaním obrazu, môže to byť skľučujúci algoritmus na zápis. Chvíľu som pracoval na probléme, ale nemohol som získať úplne spoľahlivý výsledok. Algoritmus najviac zápasil so vzorkami, ktoré mali v celom texte veľmi podobné vlastnosti, ako sú bodky na obrázku časopisu. V prílohe je kód, ktorý som napísal v Matlabe, ale potrebuje trochu práce.

Poslednou možnosťou je použiť programy na šitie gigapixelových fotografií. Nemám čo navrhnúť, ale viem, že sú tam.

Krok 10: Výkon mikroskopu

Ak ste to zmeškali, tu sú výsledky: obrázok časopisu, háčkovaný obrus a rôzna elektronika.

Špecifikácie systému sú uvedené v tabuľke vyššie. Skúsil som zobrazenie pomocou objektívu s ohniskovou vzdialenosťou 28 mm a 50 mm. Na základe difrakčného limitu (okolo 6μm) som odhadol najlepšie možné rozlíšenie systému. Je skutočne ťažké experimentálne to otestovať bez cieľa s vysokým rozlíšením. Skúsil som vytlačiť vektorový súbor uvedený na tomto fóre s veľkoformátovými fotografiami, ale bol som obmedzený rozlíšením svojej tlačiarne. Najlepšie, čo som mohol pomocou tohto výtlačku určiť, bolo, že systém mal rozlíšenie <40μm. Na vzorkách som tiež hľadal malé izolované prvky. Najmenšou vlastnosťou tlače z časopisu je atramentová škvrna, ktorú som odhadoval tiež na približne 40μm, takže som ju nemohol použiť na získanie lepšieho odhadu rozlíšenia. V elektronike boli malé divoty, ktoré boli celkom dobre izolované. Pretože som poznal zorné pole, mohol som spočítať počet pixelov zaberajúcich malý divot, aby som získal odhad rozlíšenia asi 10-15μm.

Celkovo som bol s výkonom systému spokojný, ale mám niekoľko poznámok pre prípad, že by ste si chceli tento projekt vyskúšať.

Stabilita pódia: Najprv získajte vysokokvalitné lineárne komponenty pódia. Komponenty, ktoré som použil, mali oveľa väčšiu hru, ako som si myslel. Na každý prút som použil v súprave iba jeden z posuvných úchytov, takže možno aj preto sa javisko necítilo veľmi stabilne. Mne pódium fungovalo dosť dobre, ale to by bolo pre systémy s vyšším zväčšením väčším problémom.

Optika pre vyššie rozlíšenie: Rovnakú myšlienku je možné použiť aj pre mikroskopy s vyšším zväčšením. Budú však potrebné menšie motory s jemnejšou veľkosťou kroku. Napríklad 20-násobné zväčšenie s týmto dSLR by malo za následok zorné pole 1 mm (ak mikroskop dokáže zobraziť taký veľký systém bez vinetácie). Spoločnosť Electronupdate použila krokové motory z prehrávača diskov CD v peknom prevedení pre mikroskop s vyšším zväčšením. Ďalším kompromisom bude malá hĺbka ostrosti, čo znamená, že zobrazovanie bude obmedzené na tenké vzorky a budete potrebovať jemnejší translačný mechanizmus v smere z.

Stabilita statívu: Tento systém by lepšie fungoval so stabilnejším držiakom fotoaparátu. Systém šošoviek je ťažký a statív je naklonený o 90 ° z polohy, pre ktorú je určený. Aby som pomohol so stabilitou, musel som nohy statívu oblepiť páskou. Uzávierka môže tiež dostatočne otriasť fotoaparátom a rozmazať obrázky.